化学学院吕华课题组在降低蛋白质药物免疫源性方面取得重要进展

蛋白质药物因其高特异性及高活性，近年来在癌症、自身免疫病、血友病、糖尿病等多种重大恶疾的治疗中愈发重要。然而蛋白质药物通常具有较高的免疫原性，容易引发病人免疫应答产生抗药物抗体（anti-drug antibody，简称ADA）。临床数据表明即使是人源化的蛋白质药物也会引起ADA的产生。ADA会使药物失去其效力，甚至引起严重的过敏反应威胁病人生命安全。通过对蛋白质药物进行PEG化修饰能够延长蛋白质的循环时间，并在一定程度上降低免疫原性。近年来动物实验及临床证据均表明，PEG自身具有可观的免疫原性，会诱发机体产生anti-PEG抗体（本质上也可认为是一种ADA），进而造成PEG化药物在血液中加速清除（accelerated blood clearance，简称ABC效应）。因此，寻找新型低免疫原性的抗生物污染高分子用于蛋白质修饰至关重要。

在众多潜在的PEG替代高分子中，非结构性(unstructured)的柔性高分子往往更受人们青睐。比如在长效聚多肽-蛋白质融合药物中，聚多肽的设计往往刻意排除具有明显二级结构的序列使其采取完全无规的构象。然而，这一为人们广泛采用的设计思路实际缺乏严格的实验证据支持。其客观原因在于难以设置合理的对照实验组以严格区分聚合物共价化学组成与构象二者分别的贡献——对于绝大部分高分子，要改变聚合物构象必然需要改变其共价化学组成，反之亦然。

为探讨抗生物污染高分子二级结构在降低蛋白质免疫源性方面的结构-功能关系，进而发展低免疫源性高分子用于蛋白质药物修饰，北京大学化学与分子工程学院吕华研究员课题组将研究对象聚焦于聚氨基酸（也称合成聚多肽）。聚氨基酸是一类可生物降解的合成高分子，侧链易修饰，通常具有较好的生物相容性。更为特殊的是，通过改变单体氨基酸的手性类型可以在不改变侧链化学组成的情况下得到二级结构各异（如螺旋或线团）的聚氨基酸，从而为验证聚合物二级结构效应设置较为理想的对照实验组。他们在前期的研究中已证明含寡聚乙二醇侧链的聚谷氨酸酯（P(EG3Glu)）在金基底表面表现出二级结构依赖的抗生物污染能力(Biomaterials，2018，178，728-737)，即采取螺旋结构的L-P(EG3Glu)比无二级结构的DL-P(EG3Glu)抗污能力更强。在此基础上，吕华课题组利用以上两种聚氨基酸进一步验证了螺旋结构在降低蛋白质偶联物免疫源性方面的构效关系（图1），相关成果以“Therapeutic Protein PEPylation: The Helix of Nonfouling Synthetic Polypeptides Minimizes Antidrug Antibody Generation”为题，于2019年1月在线发表于美国化学会新旗舰期刊ACS Central Science（DOI:10.1021/acscentsci.8b00548）。

图1.螺旋聚氨基酸比无规卷曲聚氨基酸或PEG在降低蛋白质药物的免疫原性方面效果更为显著

以干扰素（IFN）为模型蛋白，课题组利用自己发展的聚氨基酸与蛋白质N-端特异偶联方法（Biomacromolecules. 2016, 17, 891-896; J. Am. Chem. Soc. 2016, 138, 10995-11000; J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 1170-1178），构建了三种干扰素聚氨基酸偶联物（图2），分别是：修饰了螺旋聚氨基酸L-P(EG3Glu)的L20K-IFN，修饰了无规线团聚氨基酸DL-P(EG3Glu)的DL20K-IFN，以及修饰了传统PEG的PEG20K-IFN（bench maker）。实验结果发现，L20K-IFN在重复给药后引起的免疫反应最为微弱，具体表现在L20K-IFN在体内刺激产生的抗干扰素与抗聚氨基的抗体滴度显著低于DL20K-IFN与PEG20K-IFN两种偶联物在相同实验条件下所产生的抗体（表1）。为了验证该发现的普适性，他们采取相同的合成策略以生长激素（GH）为第二个模型蛋白构建了三种不同的偶联物：L20K-GH、DL20K-GH和PEG20K-GH（图2）。免疫实验结果再一次证实，修饰了螺旋聚氨基酸L-P(EG3Glu)的偶联物在动物体内产生的ADA最少（表1），并且在重复给药时无ABC效应；而修饰了无规卷曲聚氨基酸或PEG的两个对照组偶联物在第三次给药时表现出明显的ABC效应。

图2.携带不同二级结构高分子的蛋白质偶联物的合成

表1.携带不同二级结构高分子的蛋白质偶联物在第四次给药后小鼠血液中的ADA相对滴度

该研究通过设置严格的对照实验组，发现了对蛋白质修饰螺旋聚氨基酸可以抑制ADA的产生，其效果显著优于PEG修饰。这一结果与传统认识大相径庭，启发人们重新审视非结构性高分子用于蛋白质药物修饰的优缺点，并为人们设计新一代低免疫源性蛋白质药物提供了新思路。论文所报道的蛋白质药物的螺旋聚氨基酸化（PEPylation）具有广阔的应用前景和可观的转化潜力。

北京大学化学与分子工程学院2014级博士生侯颖钦为该论文的第一作者，吕华为通讯作者。苏州大学刘庄教授团队为本课题作出贡献。该研究得到国家重点研发计划（2016YFA0201400）、国家自然科学基金（21474004和21722401）支持。基于该技术的国际专利申请获得北京大学科技开发部专利基金资助。

编辑：麦洛